Jak ko-kryształ ketokonazolu poprawia właściwości leku?

Jak ko‐kryształ ketokonazolu poprawia właściwości leku?

Ketokonazol (KTZ), pomimo swojej skuteczności w leczeniu zakażeń grzybiczych, należy do klasy II wg Biofarmaceutycznego Systemu Klasyfikacji (BCS), charakteryzując się wysoką przepuszczalnością, ale niską rozpuszczalnością w wodzie (0,017 mg/ml). Ta niska rozpuszczalność przekłada się bezpośrednio na ograniczoną biodostępność, co w połączeniu z potencjalną hepatotoksycznością wymaga poszukiwania alternatywnych form tego leku. Inżynieria krystaliczna stanowi obiecującą technikę w badaniach farmaceutycznych, mającą na celu poprawę rozpuszczalności i innych właściwości fizykochemicznych substancji aktywnych poprzez tworzenie wieloskładnikowych produktów leczniczych.

W tym kontekście szczególnie interesujący jest ko-kryształ ketokonazolu z kwasem adypinowym (KTZ-AA), który w poprzednich badaniach wykazał 100-krotną poprawę rozpuszczalności w wodzie w porównaniu z czystym ketokonazolem. Zwiększenie rozpuszczalności i biodostępności KTZ może prowadzić do zmniejszenia wymaganej dawki terapeutycznej, a jednocześnie zapewnić ochronę wątroby. Pomimo potencjalnych działań niepożądanych, korzyści z KTZ przeważają, co doprowadziło do jego pozarejestracynego zastosowania jako terapii drugiej linii w leczeniu opornego na kastrację raka prostaty, a w 2014 roku Europejska Agencja Leków zatwierdziła KTZ HRA do stosowania doustnego w leczeniu endogennego zespołu Cushinga.

Czy badania fizykochemiczne potwierdzają bezpieczeństwo i stabilność ko‐kryształu?

Niniejsze badanie miało na celu ocenę kompatybilności ko-kryształu KTZ-AA z siedmioma wybranymi substancjami pomocniczymi: stearynianem magnezu (MgSt), laktozą jednowodną, poliwinylopirolidonem K90 (PVP K90), celulozą mikrokrystaliczną (MCC), skrobią kukurydzianą, koloidalnym dwutlenkiem krzemu (SiO₂) oraz talkiem. Wybrane substancje pomocnicze są szczególnie istotne, ponieważ są stosowane w komercyjnych doustnych formulacjach KTZ. Badanie kompatybilności substancji pomocniczych jest obowiązkowe dla czystych krystalicznych substancji aktywnych, a także dla form soli lub ko-kryształów, gdy takie formulacje są promowane jako potencjalne produkty farmaceutyczne do zatwierdzenia rynkowego.

Mieszaniny fizyczne ko-kryształu z wybranymi substancjami pomocniczymi przygotowano w stosunku wagowym 1:1, a następnie poddano analizie za pomocą różnych technik termicznych i spektroskopowych. Różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC) wykazała brak interakcji między ko-kryształem a sześcioma z badanych substancji pomocniczych. Jedynie w przypadku mieszaniny z MgSt zaobserwowano całkowicie odmienne zachowanie termiczne w porównaniu z czystymi składnikami. Krzywa DSC czystego MgSt wykazuje szeroki pik endotermiczny w zakresie temperatur 50-80°C, odpowiadający utracie wody. Natomiast krzywa DSC mieszaniny binarnej wykazuje trzy szerokie zdarzenia endotermiczne w zakresie 85-130°C, co sugeruje pewne interakcje w stanie stałym między składnikami mieszaniny. Ten profil termiczny najprawdopodobniej wynika z tworzenia układu eutektycznego między ko-kryształem a tą substancją pomocniczą, a nie z powodu interakcji chemicznej.

Analiza termograwimetryczna (TGA) potwierdziła, że stabilność termiczna ko-kryształu KTZ-AA pozostaje niezmieniona po zmieszaniu z badanymi substancjami pomocniczymi, a procesy rozkładu termicznego zachodzą zarówno dla ko-kryształu, jak i mieszanin binarnych powyżej ~140°C. Początkowa utrata masy obserwowana w tej temperaturze jest spowodowana uwolnieniem zaadsorbowanej wody. Dla wszystkich badanych mieszanin binarnych utrata masy zarejestrowana do 140°C, związana z utratą wody przez suszenie, koreluje dobrze z zawartością wody oznaczoną metodą Karla Fischera.

Dyfrakcja proszkowa promieniowania rentgenowskiego (PXRD) wykazała, że charakterystyczne piki dyfrakcyjne ko-kryształu KTZ-AA można wyróżnić we wszystkich dyfraktogramach mieszanin binarnych, co wskazuje na brak zmian strukturalnych w ko-krysztale spowodowanych interakcjami z substancjami pomocniczymi w temperaturze pokojowej. Jednak dyfraktogramy mieszanin binarnych z MCC i PVP K90 wykazują zmniejszoną krystaliczność, ze względu na amorficzny charakter tych substancji pomocniczych. Z kolei mieszanina z MgSt wykazuje poszerzenie pików dyfrakcyjnych.

Spektroskopia FT-IR potwierdziła brak chemicznych interakcji między ko-kryształem KTZ-AA a badanymi substancjami pomocniczymi w temperaturze pokojowej. Widma FT-IR wszystkich binarnych mieszanin fizycznych wykazują jedynie niewielkie przesunięcia charakterystycznych pasm wibracyjnych przypisanych czystemu ko-kryształowi KTZ-AA i badanym substancjom pomocniczym. Widma te zasadniczo reprezentują superpozycję widm poszczególnych składników.

Stabilność mieszanin ko-kryształu z substancjami pomocniczymi badano w dwóch różnych warunkach przechowywania: w warunkach środowiskowych (temperatura pokojowa, ekspozycja na intensywne światło i wilgotność otoczenia) przez 6 miesięcy oraz w warunkach przyspieszonych (40°C i 75% wilgotności względnej) przez 3 miesiące. Po przechowywaniu próbki mieszanin binarnych analizowano metodą PXRD i nie zaobserwowano zmian w położeniu ani intensywności pików ko-kryształu, co wskazuje, że nie nastąpiły żadne transformacje strukturalne. Wyniki te potwierdzają, że warunki przechowywania nie wpływają na stabilność mieszanin binarnych KTZ-AA z substancjami pomocniczymi.

Zawartość wilgoci, która może wpływać na stabilność, rozpuszczalność i ogólnie na okres przydatności stałych formulacji farmaceutycznych, oznaczano metodą miareczkowania Karla Fischera. Początkowe wartości zawartości wilgoci uzyskane metodą Karla Fischera były zgodne z wartościami określonymi metodą TGA. Po przechowywaniu w warunkach wysokiej wilgotności, oznaczona zawartość wody była głównie wilgocią zaadsorbowaną, obecną w postaci wolnej wody.

Stopień krystaliczności obliczono na podstawie danych z dyfraktogramów rentgenowskich, stosując metodę odejmowania tła. Po przechowywaniu w warunkach przyspieszonych, badane mieszaniny KTZ-AA z substancjami pomocniczymi wykazały niewielki spadek wartości krystaliczności w porównaniu z wartościami zmierzonymi przed przechowywaniem. Wyjątek stanowiły mieszaniny zawierające MgSt i talk, które wykazały niewielki wzrost wartości krystaliczności, prawdopodobnie ze względu na higroskopijny charakter tych substancji pomocniczych.

Co mówią badania in silico i teoretyczne o oddziaływaniach ketokonazolu?

Badania dokowania molekularnego przeprowadzono, aby ocenić wpływ kwasu adypinowego na powinowactwo ketokonazolu do enzymu 14-α demetylazy sterolu (CYP51) z patogennych drożdży Candida albicans. Badania in silico przeprowadzono na KTZ, AA, ko-krysztale KTZ-AA i posakonazolu, aby ocenić wpływ AA na powinowactwo KTZ do 14-α demetylazy sterolu i jego energię wiązania. Wyniki wskazują, że AA wpływa na energię wiązania KTZ w formie ko-kryształu. Niektóre konformacje uzyskały energię wiązania −12,10 kcal mol⁻¹, ale średnia energia wiązania ko-kryształu jest mniejsza o około 0,45 kcal mol⁻¹ niż KTZ. Mimo zwiększenia, energia wiązania KTZ-AA była prawie o 0,4 kcal mol⁻¹ wyższa niż posakonazolu. Oryginalny ligand posakonazol uzyskał energię wiązania −12,09 ± 0,13 kcal mol⁻¹, co wskazuje na najwyższe powinowactwo wśród badanych układów.

Podobnie jak kwas fumarowy, AA oddziałuje z 14-α demetylazą sterolu, wykorzystując swoje atomy tlenu do tworzenia wiązań wodorowych z resztami TYR118, HIS377 i SER378. Dodatkowo, reszty LEU121, PHE233, LEU376, ILE379 i MET508 tworzą szereg interakcji hydrofobowych. KTZ tworzy pojedyncze wiązanie wodorowe z HIS377 poprzez swój terminalny atom tlenu. Oddziałuje również hydrofobowo z resztami TYR64, TYR118, PHE116, THR122, ILE131, TYR132, PHE228, PRO230, PHE233, GLY303, GLY307, HIS310, THR311, LEU376, SER378, PHE380, SER507 i MET508. Ko-kryształ oddziałuje z receptorem tylko poprzez interakcje hydrofobowe, z szeregiem dodatkowych reszt, takich jak HIS377, TYR64, LEU87, LEU88, ALA117, LEU300 i TYR401, oprócz tych wymienionych powyżej dla KTZ.

Obliczenia oparte na teorii funkcjonału gęstości (DFT) wykazały, że KTZ wykazuje większą reaktywność niż posakonazol, zarówno w czystej formie, jak i w formie ko-kryształu. Reaktywność KTZ nieznacznie zmniejsza się o 0,08 eV w formie ko-kryształu, co sugeruje, że jest marginalnie bardziej stabilny niż KTZ. Jednak ogólnie rzecz biorąc, KTZ jest bardziej reaktywny niż oryginalny ligand posakonazol, zarówno w czystej, jak i w formie ko-kryształu. Różnica HLG między KTZ lub KTZ-AA a posakonazolem wynosiła około 0,7 eV. Wśród czterech ocenianych związków, AA był najbardziej stabilny. Ogólnie wartości HLG ≥ 3,54 eV wskazują, że wszystkie związki są stabilne w normalnych warunkach.

Indeks elektrofilowości, który ilościowo ocenia zdolność systemu do przyjmowania elektronów, wzrósł od posakonazolu do ko-kryształów, wskazując, że posakonazol jest mniej skłonny do przyjmowania elektronów, podczas gdy ko-kryształy są bardziej podatne na przyjmowanie elektronów ze swojego otoczenia. Ponadto, zdolność do przyjmowania elektronów KTZ zwiększyła się w formie ko-kryształu w porównaniu do jego czystej formy, będąc bardziej skłonnym do przyjmowania elektronów. Zwiększenie zdolności do przyjmowania elektronów formy ko-krystalicznej KTZ w porównaniu do jego czystej formy wykazano również w przypadku ko-kryształu ketokonazolu z kwasem fumarowym.

Przeprowadzone badania nad ko-kryształem ketokonazol-kwas adypinowy potwierdziły jego potencjał jako stała doustna postać leku, oferując obiecującą alternatywę dla leku macierzystego. Kompatybilność ko-kryształu z większością badanych substancji pomocniczych, jego stabilność chemiczna i polimorficzna, a także korzystne interakcje molekularne z docelowym enzymem czynią go atrakcyjnym kandydatem do dalszego rozwoju farmaceutycznego. Te wyniki mają szczególne znaczenie w kontekście poprawy biodostępności i zmniejszenia potencjalnej hepatotoksyczności ketokonazolu, co może prowadzić do optymalizacji terapii przeciwgrzybiczej.

Podsumowanie

Ko-kryształ ketokonazolu z kwasem adypinowym (KTZ-AA) stanowi innowacyjne rozwiązanie problemu niskiej rozpuszczalności ketokonazolu w wodzie. Badania wykazały, że ko-kryształ jest kompatybilny z sześcioma z siedmiu badanych substancji pomocniczych, wykazując jedynie specyficzne interakcje ze stearynianem magnezu. Analizy termiczne i spektroskopowe potwierdziły stabilność ko-kryształu w różnych warunkach przechowywania. Badania dokowania molekularnego wykazały, że ko-kryształ zachowuje zdolność wiązania z enzymem docelowym, choć z nieco zmienioną energią wiązania w porównaniu z czystym ketokonazolem. Obliczenia DFT potwierdziły stabilność ko-kryształu i jego zwiększoną zdolność do przyjmowania elektronów. Forma ko-krystaliczna oferuje znaczącą poprawę właściwości fizykochemicznych przy zachowaniu aktywności terapeutycznej, co czyni ją obiecującą alternatywą dla konwencjonalnej formy leku.