Nowa nadzieja w leczeniu glejaków – przełom w terapii celowanej GBM

Jakie wyzwania stawia leczenie GBM?

Odkrycie nowej metody zwiększenia skuteczności terapii celowanej w glejakach wielopostaciowych (GBM) staje się przełomowe w kontekście jednego z najtrudniejszych do leczenia nowotworów. GBM stanowi najczęstszy pierwotny złośliwy nowotwór mózgu u dorosłych, obejmujący około połowy wszystkich złośliwych guzów mózgu. Pomimo postępów w badaniach nad biologią guza i nowymi terapiami, standardowe leczenie GBM wciąż opiera się na maksymalnej bezpiecznej resekcji guza, po której następuje radioterapia i chemioterapia, z alarmująco niską medianą przeżycia wynoszącą około 14 miesięcy i mniej niż 7% wskaźnikiem pięcioletniego przeżycia.

Heterogeniczność guza, wysoki wskaźnik proliferacji, inwazyjność oraz obecność bariery krew-mózg (BBB) i bariery krew-guz (BTB) to główne czynniki utrudniające skuteczne leczenie GBM. Terapie celowane, choć obiecujące w wielu typach nowotworów, mają ograniczone zastosowanie w GBM, z bewacyzumabem jako jedynym zatwierdzonym przez FDA lekiem celowanym, który jednak nie poprawia całkowitego przeżycia pacjentów.

Czy szlaki molekularne CDK4/6 i tGLI1 otwierają nowe perspektywy terapeutyczne?

Nowe badania skupiają się na szlaku kinaz zależnych od cyklin 4/6 (CDK4/6), który odgrywa kluczową rolę w wielu nowotworach, w tym w GBM. Analiza bioinformatyczna z wykorzystaniem cBioPortal wykazała, że około 70% pacjentów z GBM ma jakieś genetyczne zmiany w kluczowych komponentach szlaku CDK4/6. Najczęstszymi zmianami są delecje genów CDKN2A i CDKN2B (odpowiednio 55% i 53%), przy czym większość pacjentów wykazuje utratę obu genów. Pacjenci z jakimikolwiek zmianami w szlaku CDK4/6 mają gorsze całkowite przeżycie (mediana: 13,76 vs 17,18 miesięcy) i krótszy czas przeżycia wolny od choroby (mediana: 7,10 vs 9,56 miesięcy) w porównaniu do pacjentów bez takich zmian.

Inhibitory CDK4/6 (CDK4/6i), takie jak abemaciclib, palbociclib i ribociclib, zostały opracowane w odpowiedzi na częste zmiany w szlaku CDK4/6 i wykazały obiecujące wyniki w leczeniu różnych typów nowotworów, w tym raka piersi, płuc, czerniaka i jelita grubego. Zostały nawet zatwierdzone przez FDA do leczenia hormonozależnego, HER2-ujemnego raka piersi. Jednak badania kliniczne oceniające monoterapię CDK4/6i u pacjentów z GBM wykazały ograniczoną skuteczność, co sugeruje istnienie mechanizmów oporności.

Przełomem w badaniach nad opornością GBM na leczenie inhibitorami CDK4/6 jest odkrycie roli skróconego homologu onkogenu związanego z glejakiem 1 (tGLI1). tGLI1 został po raz pierwszy odkryty jako nowy wariant splicingowy czynnika transkrypcyjnego GLI1 z efektem “gain-of-function” w osi SHH-PTCH1-SMO, który wykazuje ekspresję specyficzną dla nowotworów, zarówno w raku piersi, jak i w GBM.

tGLI1 napędza mezenchymalny podtyp GBM i promuje angiogenezę oraz inwazję poprzez regulację w górę CD24, VEGF-C, TEM7 i heparynazy, a także wzbogacanie populacji komórek macierzystych glejaka (GSC) poprzez regulację w górę CD44. Niedawno zidentyfikowano specyficzny inhibitor tGLI1 – ketokonazol (KCZ), zatwierdzony przez FDA lek przeciwgrzybiczy, który specyficznie hamuje komórki macierzyste raka piersi z ekspresją tGLI1 i zmniejsza obciążenie przerzutami raka piersi do mózgu w modelach mysich.

Badania wykazały, że tGLI1 czyni komórki GBM i GSC bardziej odpornymi na leczenie CDK4/6i, podczas gdy specyficzne wyciszenie tGLI1 uwrażliwia komórki na CDK4/6i. Nowa kombinacja leczenia KCZ+CDK4/6i synergistycznie hamuje tworzenie GSC, indukuje zatrzymanie cyklu komórkowego, zwiększa apoptozę, zmniejsza wzrost guza i redukuje angiogenezę in vitro i in vivo.

Czy genomika i modele in vivo ujawniają mechanizmy oporności?

Aby określić częstość zmian w szlaku CDK4/6 u pacjentów z GBM, przeprowadzono analizy bioinformatyczne przy użyciu cBioPortal. Po wykluczeniu pacjentów z mutacją dehydrogenazy izocytrynianowej (IDH-mt), zgodnie z aktualnymi kryteriami diagnostycznymi dla GBM, stwierdzono, że około 70% pacjentów z GBM miało jakieś genetyczne zmiany kluczowych komponentów szlaku CDK4/6. Co ciekawe, delecje CDKN2A i CDKN2B były najczęstszymi zmianami u pacjentów, odpowiednio 55% i 53%, przy czym większość pacjentów miała utratę obu genów. Ponadto, zmiany w innych kluczowych komponentach szlaku CDK4/6 (CDK4, CDK6, RB1) były w większości wyłączne dla delecji CDKN2A/B u pacjentów.

Z powodu braku odpowiedzi na CDK4/6i, obserwowanego w wielu badaniach klinicznych, badacze poszukiwali potencjalnych mechanizmów leżących u podstaw tej oporności terapeutycznej. Korzystając z opublikowanej sygnatury oporności na CDK4/6i (CIRS) i analizy wzbogacenia zestawu genów (GSEA), znaleziono trzy szlaki sygnalizacyjne raka, które były znacząco wzbogacone u pacjentów z wysokim wynikiem CIRS, a mianowicie β-katenina, Sonic HedgeHog (SHH) i PI3K. Ponieważ dobrze wiadomo, że szlak SHH promuje populację GSC, która jest znanym czynnikiem napędzającym oporność na leczenie w GBM, badacze zdecydowali się skupić na badaniu szlaku SHH i jego potencjalnej roli w oporności na CDK4/6i.

Biorąc pod uwagę, że niedawne prace wykazały, że GLI1 i tGLI1 glejaka są efektorami końcowymi szlaku SHH, następnie zbadano aktywność GLI1 (sygnatura aktywacji GLI1) i tGLI1 (sygnatura aktywacji tGLI1—tGAS) w odniesieniu do wyniku CIRS u pacjentów z GBM. Przeprowadzając analizę korelacji Pearsona, stwierdzono, że aktywność tGLI1 jest znacząco i pozytywnie skorelowana z CIRS u pacjentów z GBM, bez korelacji między GLI1 a CIRS. Ponadto, u pacjentów z mezenchymalnym GBM (mGBM) stwierdzono wysoki wynik sygnatury kombinowanej CIRS/tGAS w porównaniu do innych podtypów GBM. mGBM wykazuje zwiększoną stemness, inwazyjność i oporność na leczenie, co dodatkowo sugeruje rolę stemness GBM mediowanej przez tGLI1 jako potencjalnego mechanizmu oporności na CDK4/6i.

Jakie nowe strategie przeciwdziałają terapii oporności GBM?

W badaniach na modelach in vivo, komórki G48-tGLI1 zawierające reporter lucyferazy zostały wszczepione dokanałowo do prawego płata czołowego samic myszy atymicznych nagich. Po 10-dniowym okresie wszczepiania guza, zwierzęta zostały zrandomizowane, po czym myszy były leczone nośnikiem, samym KCZ (50 mg/kg, dootrzewnowo), samym abemaciclibem (50 mg/kg, doustnie) lub terapią kombinowaną KCZ+abemaciclib przez ~28 dni. Terapia kombinowana znacząco hamowała wzrost guza w porównaniu do kontroli, podczas gdy monoterapia nie miała istotnego wpływu. Wszystkie grupy leczenia były dobrze tolerowane, co określono poprzez badanie aktywności transaminazy alaninowej (ALT) w celu określenia toksyczności wątrobowej oraz monitorowanie masy ciała myszy w trakcie badania.

Mózgi myszy zostały pobrane do analizy zmian w proliferacji guza, angiogenezie i śmierci komórkowej po leczeniu przy użyciu immunohistochemii (IHC). Terapia kombinowana znacząco zwiększyła liczbę komórek pozytywnych dla Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling (TUNEL) w porównaniu do grup nośnika i monoterapii, co świadczy o zwiększonej apoptozie guza. Ponadto, leczenie oboma czynnikami znacząco zwiększyło śmierć komórkową w porównaniu do nośnika.

Dodatkowo, sekcje mózgu myszy barwiono Ki-67 i mCD31 w celu określenia zmian odpowiednio w proliferacji guza i tworzeniu mikronaczyń. Wyniki wykazały znaczący spadek pozytywności Ki-67 po terapii kombinowanej w porównaniu do grup nośnika i monoterapii, podczas gdy sama monoterapia nie wykazała istotnej zmiany w porównaniu do nośnika. Ponadto, tworzenie mikronaczyń było znacząco hamowane przez terapię kombinowaną w porównaniu do grup nośnika i samego KCZ. Wyniki te pokazują, że terapia kombinowana KCZ+abemaciclib zachowuje swój synergistyczny efekt in vivo, znacząco hamując wzrost GBM i promując apoptozę.

W celu dalszego potwierdzenia skuteczności terapii kombinowanej KCZ+abemaciclib przeciwko GBM w bardziej klinicznie istotnym modelu in vivo, wykorzystano drugi ortotopowy model ksenograftu mysiego z użyciem wysoce agresywnej linii PDX 39, która jest pozytywna dla ekspresji tGLI1 i CDK4/6. Samice myszy atymicznych nagich zostały dokanałowo zaszczepione komórkami PDX39 zawierającymi reporter lucyferazy do prawego płata czołowego, a zwierzęta były leczone nośnikiem, KCZ (50 mg/kg), abemaciclibem (50 mg/kg) lub terapią kombinowaną przez 20 dni. Po zakończeniu, mózgi zostały pobrane i poddane obrazowaniu ex vivo, gdzie wyniki wykazały znaczącą redukcję bioluminescencji mózgu w grupie terapii kombinowanej, w porównaniu do wszystkich innych grup leczenia. Dodatkowo, nie było znaczącej zmiany w masie ciała myszy w trakcie leczenia, co wskazuje, że leczenie było dobrze tolerowane.

Radioterapia jest głównym komponentem standardowego leczenia pacjentów z GBM, jednak wykazano, że GSC promują oporność na radioterapię. Wcześniejsze badania wykazały, że tGLI1 promuje populację GSC, dlatego zbadano ekspresję tGLI1 i oporność GBM na radioterapię. Izogeniczne stabilne linie G48-vector, -GLI1 i -tGLI1 zostały poddane działaniu 0 gray (Gy) lub 5 Gy promieniowania jonizującego (IR), a następnie wysiane w warunkach monowarstwy lub tworzenia sfer. Co ciekawe, nadekspresja tGLI1 nie miała wpływu na komórki G48 rosnące w warunkach monowarstwy, ale znacząco promowała przeżycie w neurosferach po IR.

Oprócz radioterapii, leczenie temozolomidem (TMZ) jest drugim komponentem standardowego leczenia pacjentów z GBM. Badano dalej rolę tGLI1 w oporności na TMZ w GBM. Izogeniczne sfery G48-tGLI1 traktowano nośnikiem, samym KCZ (2,5 μM), samym TMZ (100 μM) lub terapią kombinowaną KCZ+TMZ i liczono neurosfery w 5. dniu po początkowym leczeniu. Wyniki wykazały, że monoterapia KCZ i TMZ znacząco zmniejszyła tworzenie sfer w porównaniu do nośnika. Co ważne, leczenie kombinowane było najbardziej skuteczne w redukcji tworzenia neurosfer w porównaniu do wszystkich innych grup.

Mechanizmy molekularne leżące u podstaw oporności na CDK4/6i w GBM są złożone i wieloczynnikowe. Wcześniejsze badania wykazały, że komórki GBM z nadekspresją tGLI1 mają zwiększoną ekspresję murine double minute 2 (MDM2), czynnika, który promuje oporność GBM na CDK4/6i. Ponadto, wcześniej zidentyfikowano nową interakcję między tGLI1 a STAT3, przy czym STAT3 również jest raportowany jako czynnik promujący oporność na CDK4/6i w raku piersi. Jednak rola tych dwóch czynników w pośredniczeniu w oporności na CDK4/6i w kontekście GBM z nadekspresją tGLI1 nie została jeszcze zbadana i wymaga dalszych badań.

Innym kluczowym aspektem badań jest wykazanie zwiększonej skuteczności leczenia za pomocą terapii kombinowanej CDK4/6i i KCZ, co silnie sugeruje wartość terapeutyczną ukierunkowania na tGLI1 w GBM, aby uwolnić pełny potencjał CDK4/6i. tGLI1 jest terminalnym efektorem szlaku SHH, jednego ze szlaków, które znacząco korelują z sygnaturą oporności na CDK4/6i (CIRS). Dwa dodatkowe szlaki, a mianowicie szlaki β-kateniny i PI3K, również znacząco korelują z CIRS. W niedawnym badaniu, kombinacja inhibitora Wnt/β-kateniny (AC1Q3QWB) z palbociklibem wykazała synergizm przeciwko GBM w modelach mysich. Dodatkowo, kombinacja inhibitorów szlaku PI3K/AKT/mTOR uwrażliwiała linie komórkowe raka piersi na CDK4/6i, z podobnymi wynikami obserwowanymi w GBM. Ponadto, łączenie CDK4/6i z immunoterapiami wykazało zwiększoną skuteczność w modelach raka piersi i badaniach przerzutów do mózgu.

Odkrycia te mają znaczące implikacje translacyjne w przezwyciężaniu oporności guza na CDK4/6i, radioterapię i TMZ oraz zapobieganiu progresji guza przy jednoczesnym skutecznym leczeniu GBM za pomocą nowej terapii kombinowanej. W próbkach od pacjentów i modelach GBM in vitro stwierdzono, że aktywacja szlaku tGLI1 jest silnie skorelowana ze szlakiem CDK4/6. Ponadto, wykazano, że tGLI1 promuje oporność GBM na CDK4/6i i że podwójna inhibicja tGLI1 i CDK4/6 za pomocą KCZ i CDK4/6i ma synergistyczne efekty leczenia in vitro i in vivo. Również tGLI1 promuje oporność GBM na radioterapię, z umiarkowanymi efektami w uwrażliwianiu na radioterapię, gdy jest leczony inhibitorami CDK4/6. Na koniec, wykazano, że KCZ uwrażliwia GBM na leczenie TMZ, przedłużając okno leczenia standardową chemioterapią.

Badanie to pokazuje, że tGLI1, specyficzny wariant splicingowy GLI1, który jest obecny tylko w tkankach nowotworowych, jest nowym czynnikiem transkrypcyjnym, który można ukierunkować, a który przyczynia się do oporności na CDK4/6i i chemoradioterapię w GBM. Co ważne, zgodnie z odkryciami w przerzutowym raku piersi do mózgu, wykazano również, że KCZ, zatwierdzony przez FDA lek przeciwgrzybiczy, który przenika przez barierę krew-mózg, jest skutecznym środkiem terapeutycznym, który selektywnie wiąże się z tGLI1 i przezwycięża oporność na CDK4/6i w GBM. Zatem leczenie GBM terapią kombinowaną KCZ i CDK4/6i może zmaksymalizować pełny potencjał CDK4/6i w leczeniu GBM. Wymagane są dalsze badania kliniczne w celu oceny skuteczności tej kombinacji leków w praktyce klinicznej.

Podsumowanie

W badaniach nad glejakiem wielopostaciowym (GBM) zidentyfikowano kluczową rolę szlaku kinaz zależnych od cyklin 4/6 (CDK4/6) oraz skróconego homologu onkogenu związanego z glejakiem 1 (tGLI1) w rozwoju oporności na leczenie. Około 70% pacjentów z GBM wykazuje zmiany genetyczne w szlaku CDK4/6, co wiąże się z gorszym rokowaniem. Przełomem okazało się odkrycie, że ketokonazol (KCZ) w połączeniu z inhibitorami CDK4/6 wykazuje synergistyczne działanie w hamowaniu wzrostu guza i promowaniu apoptozy. Terapia kombinowana skutecznie redukuje populację komórek macierzystych glejaka, zmniejsza angiogenezę oraz uwrażliwia komórki nowotworowe na standardowe metody leczenia, w tym radioterapię i temozolomid. Badania na modelach in vivo potwierdziły skuteczność i bezpieczeństwo tej terapii, otwierając nowe perspektywy w leczeniu jednego z najbardziej agresywnych nowotworów mózgu.

Bibliografia

Yu Yang, Arrigo Austin, Chandra Ankush, Zhuang Chuling, Najjar Mariana K., Khan Munazza S., Zhu Dongqin, Dono Antonio, Strowd Roy E., Tandon Nitin, Zhu Jay-Jiguang, Hsu Sigmund H., Esquenazi Yoshua, Chan Michael and Lo Hui-Wen. Targeting tGLI1, a novel mediator of tumor therapeutic resistance, using Ketoconazole sensitizes glioblastoma to CDK4/6 therapy and chemoradiation. bioRxiv 2025, 47(11, Part 2), e187-e200. DOI: https://doi.org/10.1101/2025.02.20.639359.